Ο νεότερος ναός του Αγίου Ματθαίου κτίστηκε, πιθανόν ως οικογενειακό παρεκκλήσι, στην αρχή του 17ου αιώνα, στη θέση παλιότερου βυζαντινού ναού, που καταστράφηκε από σεισμό. Μετά την οθωμανική κατάκτηση, παραχωρήθηκε ως μετόχι στο ορθόδοξο μοναστήρι της Αγίας Αικατερίνης στο Όρος Σινά, αντί της Αγίας Αικατερίνης, που μετατράπηκε σε τζαμί. Στους επόμενους αιώνες, μαζί με το ναό του Αγίου Μηνά, αποτελούσαν τις δύο κύριες ορθόδοξες εκκλησίες της πόλης και για αυτό στον περίβολο του κτιρίου, είχαν ταφεί σημαίνοντα πρόσωπα της χριστιανικής κοινότητας. Σήμερα σώζονται δύο κόγχες με τοιχογραφίες στη βόρεια πλευρά, μια εντοιχισμένη επιγραφή του 1600 στη νότια θύρα του ναού. Επιπλέον ο ναός φιλοξενεί συλλογή φορητών εικόνων, στην οποία περιλαμβάνονται σημαντικά έργα της Κρητικής Σχολής, όπως «η Σταύρωση» του Γεωργίου Καστροφύλακα (1752), «ο Άγιος Τίτος και σκηνές του βίου των 10 μαρτύρων» του Ιωάννη Κορνάρου (1773) και άλλα, μεταξύ των οποίων και δύο ανυπόγραφες εικόνες του Μιχαήλ Δαμασκηνού.